Molekula klonado
Klonado baziĝas sur interŝovo de eksterdevena DNA-fragmento (insertaĵo) en vektoron (plasmido, faĝomido, bakteriofaĝo, kosmido, gista artefarita kromosomo (angle YAC), bakteria artefarita kromosomo (angle BAC)...). La klonad-vektoro estas tranĉita de restrikta enzimo kiu rekonas specifan restriktejon (ĝenerale lokita ĉe la restriktejaro ankaŭ nomita tranĉejaro) . Pro unikeco de tiu loko, la vektoro estas liniigita kaj posedas ĉe ĉiu el siaj finaĵoj, parton de DNA-sinsekvo rikonata de restrikta enzimo.
Klon-metodo per unu sama enzimo: la insertaĵo ne estas orientita. Ties orientiĝo estu poste kribrita.
Le eksterdevena DNA de doninta organismo digestiĝas per sama restrikta enzimo ol tiu uzata por la vektoro-liniigo: la diversaj havigitaj fragmentoj posedas do ankaŭ ĉe siaj finaĵoj parton rikonita de restrikta enzimo. Kiam la malfermita, liniigita plasmido kaj la interesaj DNA-fragmentoj estas metitaj en saman reakci-medion, hibridiĝoj de komplementaj kunteniĝaj finaĵoj okazas (formiĝo de hidrogenaj ligoj), laŭ la reguloj pri baz-komplementeco (A/T, G/C). Unu enzimo, la ligazo, ebligas formiĝon de kovalentaj ligoj inter tiuj hibriditaj DNA-fragmentoj kaj estas aldonita por kunligi la DNA-fragmenton, fremda al plasmido. La ago kiun havas la ligazo estas krei ligojn inter la 5'-P kaj 3'-OH finaĵoj kuntuŝigitaj de la hibridiĝo inter kunteniĝaj finaĵoj de la plasmido kaj de la fragmento. La havigita plasmido, ree cirkloforma, estas nomita « rekombininto » se ĝi integris la insertaĵon.
Kiam plasmid-devena kaj insertita DNA estas digestitaj de ununura resktrikt-enzimo, la insertaĵo povas hazarde integriĝi en plasmidon laŭ du direktoj. Tiam necesas determini la insertiĝ-direkton de la fragmento studante ekzemple la sinsekvon de la rekombininta plasmido.
Dum klonado realigita post tranĉo per unusama resktrikt-enzimo, du lig-eventoj povas okazi:
- kunligo de plasmida molekulo kun insertaĵa molekulo
- plasmido-memrecirkliĝo, sen insertaĵo. Tiu situacio ofte prezentiĝas kaj necesas ĝin forkribri.
Por favori la interŝoviĝon de fremda DNA-fragmento kaj sekve pliriĉigi la bakteriaron je rekombinintaj plasmidoj, la vektoro-memrecirkliĝa evento estas malhelpata de traktado per baza senfosforigazo, la fosforo-grupoj ĉeestantaj ĉe la finaĵoj 5'-P de la liniigita vektoro estas eliminataj tiel ke la ligazo ne plu povu katalizi la lig-formiĝon inter la du senfosforigitaj plasmido-finaĵoj kaj la fosforigitaj ekstremaĵoj de la insertaĵo.
Pli malfavoraj kazoj povas prezentiĝi. Kiam plasmido kaj fremda DNA-fragmento estis tranĉitaj de netfinaĵ-generanta resktrikt-enzimo, la principo samas, sed la lig-efiko pli malaltas. Tamen, avantaĝo de tiu far-maniero estas ebligi kunligon de kiaj ajn finaĵoj, eĉ se ili ne posedas komplementajn sinsekvojn. Estas interalie la kazo por enplasmida klonado de DNA-fragmentoj havigitaj per PĈR. Kaze de netfinaĵ-klonado, la eksterdevena DNA-fragmenta inserto povas okazi hazarde laŭ ambaŭ direktoj.
Modifo de finaĵo-strukturo
Se la klonad-vektoro kaj la eksterdevena DNA ne estis digestitaj de la sama restrikt-enzimo kaj ne posedas netfinaĵojn aŭ kongruajn finaĵojn, tiam nepras krei netfinaĵojn por interŝovi la eksterdevenan DNA en la vektoron. Temas, per ago de DNA-polimerazo, pri plenigo de la 5'-P malnetaj ekstremaĵoj, dank al ties 5'->3' polimeriga ago, aŭ pri netigo de la malnetaj 3'OH finaĵoj dank al 3'->5' fintranĉa (eksonukleaza) ago de la enzimo. Iukaze, insertaĵo kaj plasmido, ĉiu siaflanke, estas digestitaj de malsama enzimo. Tiam klonado estas unudirekta ĉar nur unu integriĝ-direkto por la insertaĵo eblas.
