Blu-blanka kribro-sistemo
Ĉe la plasmido troviĝas geno ebliganta rezisti konstraŭ antibiotiko. Ĉiuj disvolviĝantaj bakteri-kolonioj en antibiotik-enhavanta medio estas tiuj kiuj almenaŭ posedas la plasmidon kiu povas esti sen-insertaĵa aŭ kun-insertaĵa plasmido.
Kiel fari por specife selekti la bakteriojn kiuj enhavas kaj la plasmidon kaj la insertaĵon?
Dank al la blu-blanka kribrosistemo!!
Enhavo
1 Kio estas operono?
2 Normala situacio
3 Kribra situacio
4 β-galaktozidaza geno tuta
5 β-galaktozidaza geno disrompita
Kio estas operono? |
Unue kelkaj kromaj sciindaj nocioj:
Operono estas grupo de apudaj genoj kies esprimiĝo dependas de samaj promorotaj sinsekvoj kaj de samaj reguligaj sinsekvoj por ties transskribado.
La operono kiu nin koncernas estas la laktozo-operono.
Tiu laktozo-operono kodas β-galaktozidazon kiu transformas laktozon en galaktozon+glukozon.
Normala situacio |
Konverto de laktozo en galaktozon kaj glukozon fare de β-galaktozidazo
β-galaktozidazo povas ankaŭ transformi laktozon en alolaktozon. La esprimiĝo de la laktozo-operono estas induktebla.
Se oni kreskigas bakterion SEN laktozo, la laktozo-operono esprimiĝas baznivele. (≈ po 5 molekuloj de β-galaktozidazo en ĉiu bakterio).
Se oni kreskigas bakterion KUN laktozo: la laktozo-operono esprimiĝas maksimume. La esprimiĝo-nivelo obliĝas je 1000 (de 5 molekuloj oni nun havas 5000 molekulojn). La vera induktaĵo de la laktozo-operono estas alolaktozo sed ĉar tiu molekulo ankaŭ estas substrato de la β-galaktozidazo, ties kvanto malkreskas laŭ la difekt-ago de la β-galaktozidazo.
Kribra situacio |
Konverto de X-galaktozido en X kaj galaktozidon fare de β-galaktozidazo
Alia esprimo-induktaĵo estas IPTG (IzoPropil TioGalaktozido). Male al alolaktozo, ĝi pluigas induktadon pro sia ne-difekteblo.
Ne-natura substrato de β-galaktozidazo estas X-galaktozido kies difekto rezultas el galaktozido kaj el X kiu kolorigas bakteriojn bluen.
La plasmida tranĉejaro troviĝas en la operono de la β-galaktozidazo. La tranĉejaro-sinsekvo estas 3-multoblo tiel ke sen insertaĵo-enplasmidiĝo, transskribazo laŭlegkadre povas preterlegi sen deŝovo la β-galaktozidazo-sinsekvon.
β-galaktozidaza geno tuta |
Efiko pri bakteri-koloro de nura fermita plasmido sen insertaĵo
Se la β-galaktozidazo-operono ne estas disrompita, β-galaktozidazo esprimiĝas kaj X-galaktozido estas difektita en X kaj galaktozidon, X estas blua produktaĵo do la bakterioj koloriĝas bluen.
β-galaktozidaza geno disrompita |
Efiko pri bakteri-koloro de plasmido malfermita aŭ enhavanta insertaĵon
Se la β-galaktozidazo-operono estas disrompita de insertaĵo, β-galaktozidazo ne plu estos produktita kaj ne povos difekti X-galaktozidon aldonitan al kulturmedio. Pro tio, X kiu estas bluaĵo ne produktiĝas kaj la bakterioj gastigantaj tiun disrompitan konstruaĵon restos normalkoloraj (blankaj).
Kompreneble, la bakteri-kolonioj kiuj interesas nin estas la blankaj (kiuj enhavas la insertaĵon).
Per antiobiotiko-rezisteco kaj koloriĝo oni povas do selekti la mikroorganismajn koloniojn kiuj enhavas la celitan DNA-konstruaĵon. La bakterioj de tiuj kolonioj povas esti krome kultivataj kaj ties plasmidoj elĉeligitaj per apartaj eksperimentaj protokoloj (vidu Transformo).
Alia DNA-amplifa tekniko kiu envitre ebligas DNA-obligadon estas PĈR (polimeraza ĉen-reakcio).
